一、檢測(cè)原理

1. 分光光度法：以蘆丁（或槲皮素）為標(biāo)準(zhǔn)品，通過硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法生成穩(wěn)定的黃色絡(luò)合物，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。
2. HPLC法：通過色譜分離單黃酮組分（如黃芩苷、蘆丁等），結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定量，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品分析。

二、檢測(cè)項(xiàng)目關(guān)鍵步驟

1. 樣品前處理

• 提取溶劑選擇：乙醇、甲醇或水（根據(jù)黃酮極性選擇）。
• 提取方法：
  • 超聲輔助提取：樣品與溶劑混合后超聲20–30分鐘，低溫離心取上清液。
  • 回流提取：適用于熱穩(wěn)定黃酮，常采用60–80℃加熱回流1–2小時(shí)。
• 純化步驟：必要時(shí)通過大孔樹脂、聚酰胺柱層析去除干擾物質(zhì)（如多糖、色素）。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

• 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶解，配制成0.1–1.0 mg/mL系列濃度梯度。
• 顯色反應(yīng)：取標(biāo)準(zhǔn)液加入5%亞硝酸鈉（0.3 mL），靜置6分鐘；加入10%硝酸鋁（0.3 mL），靜置6分鐘；再加入4% NaOH（4 mL），定容后于510 nm測(cè)定吸光度。
• 線性范圍：標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足R²≥0.999，濃度范圍通常為10–100 μg/mL。

3. 樣品測(cè)定

• 顯色與測(cè)定：處理后的樣品液按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟顯色，平行測(cè)定3次，取平均值。
• 空白對(duì)照：以提取溶劑代替樣品液進(jìn)行空白校正。
• 計(jì)算公式： 總黃酮含量(mg/g)=?×?×??×1000總黃酮含量(mg/g)=M×1000C×V×N? 其中， ?C：樣品液濃度（μg/mL）； ?V：定容體積（mL）； ?N：稀釋倍數(shù)； ?M：樣品質(zhì)量（g）。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 顯色條件控制：
   • 反應(yīng)時(shí)間、溫度和pH需嚴(yán)格統(tǒng)一，避免顯色不完全或褪色。
   • 硝酸鋁和亞硝酸鈉需現(xiàn)用現(xiàn)配。
2. 干擾因素排除：
   • 樣品中多酚、鞣質(zhì)等可能干擾顯色，需通過純化去除。
   • 深色樣品（如黑枸杞）需額外脫色處理。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品選擇：
   • 根據(jù)樣品黃酮類型選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品（如銀杏樣品選槲皮素）。
4. 方法驗(yàn)證：
   • 通過加標(biāo)回收率（80–120%）、精密度（RSD<5%）驗(yàn)證準(zhǔn)確性。

四、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 食品行業(yè)：檢測(cè)果蔬、茶葉、蜂蜜等食品的總黃酮含量。
2. 藥品質(zhì)量控制：如銀杏葉制劑、連花清瘟膠囊等中成藥的含量標(biāo)準(zhǔn)。
3. 科研開發(fā)：篩選高黃酮含量的植物資源或優(yōu)化提取工藝。
4. 保健品功效評(píng)價(jià)：關(guān)聯(lián)總黃酮含量與抗氧化活性（如DPPH法）。

五、方法對(duì)比與選擇建議

• 常規(guī)質(zhì)檢或初步篩選可采用分光光度法。
• 研究級(jí)分析或需明確黃酮組成時(shí)選擇HPLC法。

六、結(jié)語