核酸定量PCR檢測(cè)：核心檢測(cè)項(xiàng)目詳解

一、病原體檢測(cè)：精準(zhǔn)追蹤感染程度

• 病毒：如SARS-CoV-2（靶基因：ORF1ab、N基因）、HIV（病毒載量）、HPV（分型檢測(cè)）等。
• 細(xì)菌：結(jié)核分枝桿菌（rpoB基因）、肺炎支原體等。
• 真菌：侵襲性念珠菌（ITS區(qū)域）。

• 咽拭子、血液、痰液、腦脊液、組織活檢等。

1. 核酸提取：針對(duì)不同病原體選擇DNA/RNA提取試劑盒（如病毒RNA需反轉(zhuǎn)錄為cDNA）。
2. 引物/探針設(shè)計(jì)：靶向病原體特異性保守區(qū)域，避免交叉反應(yīng)。
3. 定量分析：通過Ct值（擴(kuò)增閾值循環(huán)數(shù)）結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病原體載量。

• 診斷：區(qū)分活動(dòng)性感染與既往感染（如HIV病毒載量＞50 copies/mL提示需治療）。
• 療效監(jiān)測(cè)：動(dòng)態(tài)觀察抗病毒治療中病毒載量下降趨勢(shì)。
• 流行病學(xué)：追蹤疫情傳播強(qiáng)度（如新冠爆發(fā)期間的病毒定量）。

二、基因表達(dá)分析：解碼分子機(jī)制

• 癌癥相關(guān)基因：如p53（抑癌基因）、HER2（乳腺癌靶點(diǎn)）。
• 炎癥因子：IL-6、TNF-α等。
• 耐藥基因：如EGFR T790M突變（肺癌靶向治療耐藥標(biāo)志）。

1. RNA質(zhì)量控制：A260/A280比值＞1.8，RIN值（RNA完整性）＞7。
2. 反轉(zhuǎn)錄：使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，避免基因組DNA污染。
3. 相對(duì)定量：采用ΔΔCt法，以內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin）標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量。

• 機(jī)制研究：揭示基因在疾病通路中的調(diào)控作用。
• 生物標(biāo)志物挖掘：篩選預(yù)后相關(guān)基因（如高表達(dá)Ki-67提示腫瘤侵襲性強(qiáng)）。
• 藥物開發(fā)：評(píng)估化合物對(duì)靶基因的調(diào)控效應(yīng)。

三、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)：保障生物安全

• 通用元件：CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子。
• 特定基因：如抗蟲Bt基因（Cry1Ab）、耐除草劑EPSPS基因。

• 植物組織研磨后CTAB法提取DNA，食品樣本需去除PCR抑制劑（如多糖、多酚）。

1. 篩查檢測(cè)：確認(rèn)是否存在轉(zhuǎn)基因成分（定性）。
2. 品系鑒定：通過事件特異性引物區(qū)分不同轉(zhuǎn)基因品系（如MON810 vs. Bt11玉米）。
3. 定量分析：計(jì)算轉(zhuǎn)基因成分占總DNA的比例（歐盟閾值：0.9%）。

四、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)療

• 基因突變：EGFR、KRAS、BRAF突變（指導(dǎo)靶向用藥）。
• 融合基因：BCR-ABL（慢性粒細(xì)胞白血病）、ALK融合（非小細(xì)胞肺癌）。
• 甲基化標(biāo)志物：SEPT9（結(jié)直腸癌早期篩查）。

• 組織活檢（金標(biāo)準(zhǔn)）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、胸腔積液等。

• 數(shù)字PCR（dPCR）輔助：對(duì)低頻突變（＜0.1%）具有更高靈敏度。
• 多重檢測(cè)：同時(shí)分析多個(gè)突變位點(diǎn)（如肺癌EGFR 19外顯子缺失/L858R/T790M）。

• 伴隨診斷：篩選適合EGFR-TKI治療的肺癌患者。
• 療效預(yù)測(cè)：治療后ctDNA中突變豐度下降提示治療響應(yīng)。
• 復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)：術(shù)后ctDNA陽性預(yù)示微小殘留病灶。

五、操作流程與質(zhì)控要點(diǎn)

1. 樣本預(yù)處理：
   • 血液：EDTA抗凝，離心分離血漿/白細(xì)胞。
   • 組織：液氮速凍后機(jī)械粉碎，避免RNA降解。
2. 防污染措施：
   • 分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)）。
   • 使用UNG酶（防擴(kuò)增產(chǎn)物污染）。
3. 質(zhì)控品設(shè)置：
   • 內(nèi)參基因（確保提取效率）、陰性對(duì)照（不含模板）、陽性對(duì)照（已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品）。

六、未來展望