細胞破壞率檢測：關鍵檢測項目與技術解析

一、細胞膜完整性檢測

1. • 原理：臺盼藍為水溶性染料，不能穿透完整細胞膜，但可進入膜破損細胞并染色。
   • 操作：將細胞懸液與臺盼藍混合，顯微鏡下計數未染色（活細胞）與染色（死細胞）的比例。
   • 應用：快速評估細胞存活率，常用于細胞培養傳代前的質量控制。
   • 優缺點：成本低、操作簡單，但靈敏度較低，無法區分早期凋亡與壞死。
2. • 原理：PI為核酸染料，不能穿透活細胞膜，但可進入膜破損細胞，與DNA結合后發出紅色熒光。
   • 操作：將細胞與PI孵育，通過流式細胞儀檢測熒光信號，區分活細胞（PI陰性）與死細胞（PI陽性）。
   • 應用：高通量檢測細胞死亡率，適用于大規模藥物篩選或毒性實驗。
   • 優缺點：靈敏度高，可定量分析，但需專業設備支持。
3. • 原理：LDH是胞漿內酶，細胞膜破損后釋放至培養基，通過檢測LDH活性推斷細胞破壞率。
   • 操作：收集細胞上清液，加入底物（如NAD+、乳酸），通過比色法或熒光法測定LDH催化反應產物（如NADH）。
   • 應用：非侵入性檢測，適合動態監測細胞損傷（如長時間藥物處理實驗）。
   • 優缺點：無需處理細胞，但可能受血清中LDH干擾，需設置無細胞對照。

二、細胞代謝活性檢測

1. • 原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將MTT（四甲基偶氮唑鹽）還原為紫色甲瓚結晶，溶解后測定吸光度。
   • 操作：加入MTT孵育，溶解結晶后使用酶標儀檢測OD570nm。
   • 應用：評估藥物或環境因素對細胞增殖/活性的影響。
   • 局限性：依賴線粒體功能，不適用于線粒體受損但膜完整的早期凋亡細胞。
2. • 原理：Calcein-AM為脂溶性非熒光物質，可穿透活細胞膜，被胞內酯酶水解為綠色熒光產物Calcein，滯留于活細胞內。
   • 操作：染色后通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測熒光強度。
   • 優勢：可實時監測活細胞動態變化，兼容活細胞成像。

三、細胞內容物泄漏檢測

1. • 原理：活細胞通過ATP酶維持胞內ATP濃度，死細胞ATP迅速降解。使用熒光素酶系統檢測培養基中ATP水平。
   • 操作：加入熒光素酶底物，通過化學發光值反映ATP含量。
   • 適用場景：快速檢測細胞死亡率（如工業發酵罐中的細胞狀態監控）。
2. • 原理：凋亡細胞DNA斷裂成180-200bp片段，通過瓊脂糖凝膠電泳（DNA Ladder）或TUNEL法（末端標記）檢測。
   • 意義：區分凋亡與壞死，適用于機制研究（如化療藥物誘導的細胞死亡途徑）。

四、齊全檢測技術

1. • 結合多通道熒光標記（如Hoechst核染色、Annexin V/PI雙染），自動分析細胞膜完整性、凋亡標志物及形態學變化。
   • 優勢：單細胞水平多參數分析，適用于復雜模型（如3D類器官）。
2. • 利用微流控裝置模擬體內微環境，實時監測細胞受力或毒性暴露后的膜完整性變化。
   • 應用：動態研究機械應力（如血流剪切力）對細胞的損傷。

五、實驗設計要點

1. 對照設置：包括陽性對照（完全裂解細胞）和陰性對照（未處理活細胞），確保檢測系統有效性。
2. 時間窗口選擇：根據細胞死亡動力學（如凋亡在數小時內發生，壞死較慢）確定檢測時間點。
3. 多方法聯用：結合膜完整性（PI染色）與代謝活性（MTT）檢測，提高結果可靠性。