引言

檢測原理

• 內源基因（質控基因）：驗證DNA提取質量（如大豆凝集素基因 Le1）。
• 外源基因：篩查通用元件（如35S啟動子、NOS終止子）及品系特異性基因（如 CP4-EPSPS）。
• 品系特異性序列：鑒定特定轉化事件（如GTS 40-3-2的旁側序列）。

檢測項目詳述

1. 內源基因檢測（質量控制）

• 目的：確認DNA提取有效且無PCR抑制物。
• 靶標基因：大豆凝集素基因 Le1（預期條帶：118 bp）。
• 意義：若 Le1 未擴增，表明DNA降解或存在抑制物，需重新提取樣本。

2. 外源基因篩查（轉基因成分初篩）

• (1) 通用調控元件檢測
  • 35S啟動子（CaMV 35S）：檢測多數轉基因作物的通用啟動子（預期條帶：195 bp）。
  • NOS終止子（農桿菌來源）：篩查外源基因的轉錄終止信號（預期條帶：180 bp）。
• (2) 標記基因檢測
  • CP4-EPSPS 基因：抗草甘膦轉基因大豆的核心外源基因（預期條帶：172 bp）。

3. 品系特異性檢測（轉化事件鑒定）

• 靶標：外源基因插入位點的旁側序列（如GTS 40-3-2品系的基因組-外源DNA連接區）。
• 示例引物：
  • 正向引物：靶向大豆基因組插入位點側翼序列。
  • 反向引物：靶向 CP4-EPSPS 基因。
• 意義：區分不同轉基因品系（如MON87701與GTS 40-3-2），避免外源基因相同導致的誤判。

4. 陰性對照與空白對照

• 陰性對照：非轉基因大豆DNA，確保無假陽性。
• 空白對照：無菌水替代模板，排除試劑污染。

檢測流程關鍵步驟

1. DNA提取：采用CTAB法或試劑盒提取，測定A260/A280比值（1.8~2.0）。
2. PCR擴增：
   • 反應體系：含 Taq 酶、dNTPs、特異性引物對。
   • 循環條件：預變性（94℃, 5 min）→ 35循環（94℃變性, 55~60℃退火, 72℃延伸）→ 終延伸（72℃, 7 min）。
3. 電泳分析：1.5%~2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察預期條帶。

結果判定

• 陽性：內源基因（Le1）+ 至少一個外源基因條帶同時出現。
• 陰性：僅內源基因條帶，無非特異擴增。
• 無效：內源基因未檢出，需重復實驗。

注意事項與質量控制

1. 防污染措施：分區操作、使用UNG酶降解殘留DNA。
2. 引物驗證：BLAST比對確保特異性，避免非靶標擴增。
3. 重復實驗：陽性結果需兩次獨立實驗確認。
4. 標準物質對照：使用已知轉基因含量標準品（如5% GTS 40-3-2）驗證靈敏度。

技術局限性與展望

• 局限性：定性PCR無法定量，且依賴已知序列信息。
• 發展趨勢：多重PCR同步檢測多靶標，數字PCR提升定量精度，結合側翼序列測序應對新型轉基因事件。

結語