蛋白質含量測定方法及檢測項目詳解

1. 凱氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 檢測項目：總氮含量
• 原理：通過高溫消解將蛋白質中的氮轉化為銨鹽，蒸餾后滴定測定總氮量，乘以蛋白質換算系數（通常為6.25）得到蛋白質含量。
• 應用：食品、農產品、飼料等總蛋白的法定檢測。
• 注意事項：
  • 需扣除非蛋白氮（如尿素、硝酸鹽）的干擾。
  • 步驟繁瑣，耗時較長，需專業操作。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 檢測項目：總蛋白濃度
• 原理：堿性條件下，蛋白質將Cu²?還原為Cu?，與BCA試劑生成紫色復合物，在562 nm處測定吸光度。
• 應用：細胞裂解液、血清、組織勻漿等溶液中的蛋白定量。
• 注意事項：
  • 受強還原劑（如DTT、巰基乙醇）干擾，需控制濃度。
  • 靈敏度高（0.5–2000 μg/mL），適合微量樣品。

3. Bradford法（考馬斯亮藍法）

• 檢測項目：總蛋白濃度
• 原理：考馬斯亮藍G-250與蛋白質的堿性氨基酸結合，顏色由棕變藍，595 nm處檢測吸光度變化。
• 應用：快速檢測純化蛋白或粗提液中的總蛋白。
• 注意事項：
  • 受去垢劑（如SDS）和堿性緩沖液影響，需優化反應條件。
  • 標準曲線需與待測蛋白種類匹配。

4. Lowry法（Folin-酚試劑法）

• 檢測項目：酪氨酸/色氨酸含量
• 原理：雙縮脲反應結合Folin-酚試劑顯色，檢測750 nm處吸光度。
• 應用：需要高靈敏度的微量蛋白檢測（如酶純化）。
• 注意事項：
  • 受硫醇類、糖類、Tris緩沖液干擾。
  • 步驟復雜，顯色不穩定，需嚴格控制反應時間。

5. 紫外吸收法（UV Absorption）

• 檢測項目：純化蛋白濃度
• 原理：利用蛋白質中芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）在280 nm處的紫外吸收。
• 應用：純化蛋白溶液（如層析洗脫液）的快速測定。
• 注意事項：
  • 核酸污染（260 nm吸收）需校正（A280/A260比值法）。
  • 不同蛋白消光系數差異大，需已知摩爾吸光系數。

6. 熒光染料法（如NanoOrange、Qubit）

• 檢測項目：總蛋白濃度
• 原理：熒光染料與蛋白質疏水區結合后發射熒光，強度與濃度正相關。
• 應用：極低濃度樣品（ng/mL級）或微量體積檢測。
• 注意事項：
  • 需專用熒光分光光度計，成本較高。
  • 染料對蛋白種類敏感，需匹配標準品。

7. ELISA（酶聯免疫吸附測定）

• 檢測項目：特異性抗原/抗體濃度
• 原理：利用抗原-抗體特異性結合，酶標記放大信號，顯色后定量。
• 應用：復雜樣品（如血液、組織液）中特定蛋白的定量分析。
• 注意事項：
  • 需高質量抗體，存在交叉反應風險。
  • 可檢測低至pg/mL級目標蛋白。

8. 質譜法（Mass Spectrometry）

• 檢測項目：特定蛋白質/多肽的絕對定量
• 原理：電離蛋白質后根據質荷比（m/z）分析，結合同位素標記內標定量。
• 應用：蛋白質組學研究、生物標志物發現。
• 注意事項：
  • 設備昂貴，需專業技術支持。
  • 可同時檢測多種蛋白，靈敏度達fmol級。

選擇檢測方法的關鍵因素

1. 樣品類型：粗提液（BCA/Bradford）、純化樣品（紫外法）、復雜基質（ELISA/質譜）。
2. 檢測目標：總蛋白（BCA、Bradford）、特定蛋白（ELISA、質譜）、氨基酸組成（Lowry）。
3. 靈敏度要求：微量樣品選熒光法或ELISA，常規檢測用比色法。
4. 干擾物質：避免還原劑、去垢劑、核酸等對特定方法的干擾。
5. 設備與成本：快速篩查可選Bradford法，高精度研究需質譜或ELISA。