- 篩查檢測項目
- 35S啟動子（P-CaMV35S）：轉基因通用元件
- NOS終止子（T-NOS）：農桿菌來源終止序列
- 品系特異性檢測（55-1事件）：PRSV-CP外殼蛋白基因
- 內源對照基因
- 木瓜幾丁質酶基因（CHY）：驗證DNA提取質量
- 引物序列：CHY-F 5'-CTTCGCTGCCTTCTTAATGC-3' CHY-R 5'-TCCTCGGCAACAAATGATGA-3'
- DNA提取與質檢
- 采用CTAB法提取木瓜果肉DNA
- 濃度要求：≥20 ng/μL（NanoDrop測定）
- 純度標準：A260/A280=1.8-2.0
- 多重PCR體系（25 μL）
- 組分配置： ├─10×PCR Buffer（含Mg²?）2.5 μL ├─dNTPs（2.5 mM）2 μL ├─引物混合液（10 μM）各0.5 μL ├─Taq酶（5 U/μL）0.25 μL ├─模板DNA 50 ng └─ddH?O補至終體積
- 熱循環參數
- 預變性：95℃ 5 min
- 35輪擴增： └─95℃ 30 s → 58℃ 30 s → 72℃ 45 s
- 終延伸：72℃ 5 min
- 瓊脂糖凝膠配制
- 2%濃度（含0.5 μg/mL EB）
- 電泳條件：100 V 35 min
- 預期產物長度
- 35S啟動子：195 bp
- NOS終止子：180 bp
- 55-1事件：301 bp
- CHY基因：438 bp
- 對照設置
- 陽性對照：GM木瓜標準物質DNA
- 陰性對照：非轉基因木瓜DNA
- 空白對照：雙蒸水替代模板
- 結果判定標準
- 陽性：靶標基因與內源基因均出現特異條帶
- 陰性：僅在CHY基因處出現438 bp條帶
- 無效：所有泳道無條帶需重新檢測
- 靈敏度測試
- 最低檢出限：0.1%轉基因成分含量
- DNA檢測下限：5 copies/反應
- 特異性驗證
- 對玉米MON810、大豆GTS40-3-2等常見轉基因作物無交叉反應
- 防污染措施
- 分區域操作（試劑準備區/樣品處理區/PCR擴增區）
- 使用帶濾芯槍頭
- 定期紫外消毒實驗臺面
- 異常結果處理
- 重復檢測≥2次驗證
- 采用實時熒光PCR法復核
- 必要時送第三方實驗室驗證
材料實驗室
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