副溶血性弧菌檢測技術(shù)指南（冷鮮、凍品）

一、概述

二、檢測項(xiàng)目及方法

1. 定性檢測（是否存在目標(biāo)菌）

• 適用范圍：冷鮮、凍品等食品樣本的初步篩查。
• 檢測步驟：
  1. 增菌培養(yǎng)：使用3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）于37℃增菌6-8小時(shí)。
  2. 選擇性分離：轉(zhuǎn)種至硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。副溶血性弧菌在TCBS上形成藍(lán)綠色菌落（不發(fā)酵蔗糖）。
  3. 生化鑒定：
     • 氧化酶試驗(yàn)（陽性）、
     • 嗜鹽性試驗(yàn)（在0%、3%、6%、8% NaCl中生長情況）、
     • 糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖+/乳糖-）。

2. 定量檢測（菌落計(jì)數(shù)）

• 適用范圍：評估樣本中副溶血性弧菌的污染程度。
• 檢測步驟：
  1. 直接平板法：稀釋樣本后接種于TCBS平板，計(jì)數(shù)典型菌落（CFU/g）。
  2. MPN法（最可能數(shù)法）：通過三管法或多管法結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型估算菌濃度。

3. 毒力基因檢測

• 檢測目標(biāo)：致病性菌株的鑒定（如耐熱直接溶血素基因tdh、耐熱相關(guān)溶血素基因trh）。
• 方法：
  • PCR擴(kuò)增：使用特異性引物擴(kuò)增tdh和trh基因片段。
  • 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）：快速、高靈敏度檢測。

4. 血清學(xué)分型

• 目的：流行病學(xué)溯源（如O抗原和K抗原分型）。
• 方法：凝集試驗(yàn)或分子分型技術(shù)（如全基因組測序）。

三、樣本處理（冷鮮與凍品差異）

1. 冷鮮樣品：
   • 立即檢測或4℃保存不超過24小時(shí)。
   • 無菌取可食用部分（如肌肉組織）25g，加入225mL 3% NaCl堿性蛋白胨水均質(zhì)。
2. 凍品樣品：
   • 解凍條件：45℃水浴≤15分鐘或2-8℃緩慢解凍。
   • 避免反復(fù)凍融，防止菌體破裂影響定量結(jié)果。

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 生物安全：副溶血性弧菌為潛在致病菌，實(shí)驗(yàn)需在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
2. 干擾因素：
   • 凍品解凍后可能因細(xì)胞損傷導(dǎo)致假陰性，需結(jié)合增菌步驟。
   • 冷鮮樣品中競爭菌群（如其他弧菌）可能抑制目標(biāo)菌生長，需優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基。
3. 方法驗(yàn)證：
   • 陽性對照：使用標(biāo)準(zhǔn)菌株（如ATCC 17802）。
   • 陰性對照：添加無菌生理鹽水。

五、結(jié)果判定與報(bào)告

• 陰性結(jié)果：未檢出副溶血性弧菌（<1 CFU/g或未檢測到目標(biāo)基因）。
• 陽性結(jié)果：
  • 定性：檢出副溶血性弧菌（需備注是否攜帶tdh或trh基因）。
  • 定量：報(bào)告具體CFU/g或MPN/g數(shù)值。
• 限值標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB 29921-2021），即食水產(chǎn)品中副溶血性弧菌限量為100 MPN/g。

六、新興檢測技術(shù)

1. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）：無需復(fù)雜設(shè)備，適用于現(xiàn)場快速檢測。
2. 免疫磁珠分離（IMS）：結(jié)合抗體富集目標(biāo)菌，提高靈敏度。
3. 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）：快速鑒定菌種。

七、

• GB 4789.7-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)
• ISO/TS 21872-1:2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae