白斑綜合征病毒（WSSV）檢測技術及項目詳解

一、WSSV檢測的重要性

二、核心檢測項目及技術方法

1. 臨床觀察與組織病理學檢測

• 項目目標：初步判斷感染跡象。
• 方法：
  • 肉眼觀察：檢查對蝦體表白斑、肝胰腺顏色變化。
  • 組織切片染色：取鰓、肝胰腺等組織，經H&E染色后顯微鏡觀察，可見細胞核內嗜堿性包涵體。
• 特點：操作簡單，但靈敏度低，無法區分WSSV與其他病原。

2. 分子生物學檢測（金標準）

• 項目目標：病毒核酸的定性/定量分析。
• 主要技術：
  • 常規PCR：
    • 靶基因：VP28、VP664等保守基因。
    • 靈敏度：可檢測10²-10³ copies/μL，適用于實驗室確診。
  • 實時定量PCR（qPCR）：
    • 優勢：高靈敏度（10 copies/μL以下）、可定量病毒載量，評估感染階段。
    • 應用：監測親蝦、苗種及環境樣本的病毒污染水平。
  • 環介導等溫擴增（LAMP）：
    • 特點：無需復雜設備，60-65℃恒溫擴增，30-60分鐘出結果，適用于現場快速檢測。
• 樣本類型：對蝦組織（鰓、肝胰腺）、水體、底泥、餌料等。

3. 免疫學檢測

• 項目目標：病毒抗原的快速篩查。
• 主要技術：
  • 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：
    • 原理：利用WSSV特異性抗體（如抗VP28單抗）捕獲抗原。
    • 適用場景：大批量樣本的初篩，靈敏度低于PCR。
  • 免疫層析試紙條（Lateral Flow Assay, LFA）：
    • 優勢：10-15分鐘快速出結果，適合養殖場現場使用。
    • 局限性：可能出現假陰性（病毒載量低時）。

4. 電子顯微鏡技術

• 項目目標：直接觀察病毒粒子形態。
• 方法：負染或超薄切片后透射電鏡（TEM）觀察，WSSV呈桿狀，大小約120×275 nm。
• 特點：特異性高，但設備昂貴、操作復雜，多用于科研或疑難樣本復核。

5. 環境監測與溯源分析

• 項目目標：追蹤病毒污染源，阻斷傳播鏈。
• 檢測對象：
  • 養殖水體、底泥中的游離病毒。
  • 活體載體（如橈足類、甲殼類）的攜帶狀態。
  • 飼料、工具等可能的污染物。
• 技術選擇：qPCR或LAMP為主，結合超濾濃縮技術提高檢出率。

6. 新興檢測技術

• CRISPR-Cas系統：基于CRISPR-Cas12a/Cas13a的核酸檢測技術，可實現超靈敏、可視化檢測（如試紙條顯色）。
• 數字PCR（dPCR）：絕對定量病毒核酸，適用于低載量樣本（如親蝦卵巢）。
• 宏基因組測序：用于未知病原篩查或病毒變異株鑒定。

三、檢測流程標準化

1. 樣本采集與保存：
   • 活體樣本：取鰓絲、肝胰腺等組織，-80℃保存或置于RNA保存液中。
   • 環境樣本：水體需過濾濃縮，底泥需離心取上清。
2. 核酸提取：推薦使用試劑盒（如QIAGEN DNeasy）避免抑制劑干擾。
3. 質量控制：
   • 設置陽性對照（含WSSV質粒）和陰性對照（無核酸水）。
   • 多重檢測內參基因（如EF1α）排除假陰性。

四、檢測技術的選擇策略

五、挑戰與未來方向

• 病毒變異：需定期更新引物/探針設計以覆蓋新毒株。
• 現場檢測：開發便攜式設備（如微型PCR儀）實現“養殖池邊診斷”。
• 多聯檢測：整合WSSV與其他病原（如EHP、IHHNV）的同步篩查。

六、