一、蛋白質(zhì)檢測的主要方法

1. 凱氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 原理：通過測定樣品中的總氮含量，乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)（通常為6.25）估算蛋白質(zhì)含量。
• 步驟：消解樣品→蒸餾→滴定。
• 優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)典方法，適用于固體、液體樣品，常用于食品行業(yè)（如牛奶、谷物）。
• 缺點(diǎn)：耗時（需數(shù)小時）、無法區(qū)分蛋白質(zhì)與非蛋白氮（如尿素）。
• 適用場景：食品質(zhì)量監(jiān)控、飼料分析。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 原理：在堿性條件下，Cu²?被蛋白質(zhì)還原為Cu?，與BCA試劑結(jié)合生成紫色復(fù)合物，在562 nm處測吸光度。
• 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（檢測下限1-20 μg/mL），抗表面活性劑干擾能力強(qiáng)。
• 缺點(diǎn)：受螯合劑（如EDTA）和高濃度還原劑影響。
• 適用場景：細(xì)胞裂解液、血清、含去污劑的樣品。

3. Bradford法

• 原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后發(fā)生顏色變化（棕色→藍(lán)色），在595 nm處測定吸光度。
• 優(yōu)點(diǎn)：快速（5-15分鐘）、操作簡單。
• 缺點(diǎn)：對不同蛋白質(zhì)響應(yīng)差異大（需使用同源標(biāo)準(zhǔn)品）。
• 適用場景：常規(guī)實驗室檢測、酶活性測定。

4. Lowry法（Folin-酚試劑法）

• 原理：蛋白質(zhì)與Cu²?在堿性條件下形成復(fù)合物，進(jìn)一步還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑生成藍(lán)色產(chǎn)物，在750 nm處檢測。
• 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高于Bradford法。
• 缺點(diǎn)：步驟繁瑣，受酚類、糖類等物質(zhì)干擾。
• 適用場景：純化蛋白質(zhì)的定量分析。

5. 紫外吸收法

• 原理：利用蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸在280 nm處的紫外吸收特性。
• 優(yōu)點(diǎn)：無需試劑，快速無損。
• 缺點(diǎn)：核酸（260 nm吸收）會干擾結(jié)果，需通過經(jīng)驗公式校正。
• 適用場景：純化蛋白質(zhì)溶液（如色譜分離后的樣品）。

6. ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）

• 原理：基于抗原-抗體特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)二抗催化底物顯色，定量目標(biāo)蛋白。
• 優(yōu)點(diǎn)：特異性高，可檢測復(fù)雜樣品中的低豐度蛋白。
• 缺點(diǎn)：需特定抗體，成本較高。
• 適用場景：疾病標(biāo)志物檢測（如腫瘤蛋白）、生物制藥質(zhì)控。

7. SDS-PAGE結(jié)合Western Blot

• 原理：通過電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后利用抗體進(jìn)行半定量分析。
• 優(yōu)點(diǎn)：可同時分析分子量及含量。
• 缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，適用于相對定量。
• 適用場景：研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾。

二、檢測項目的選擇依據(jù)

1. 樣品類型：成分復(fù)雜性（如是否含脂類、糖類、去污劑）。
2. 靈敏度需求：微量樣品可選BCA法或熒光標(biāo)記法。
3. 檢測速度：快速篩查常用Bradford法或紫外吸收法。
4. 設(shè)備條件：分光光度計、酶標(biāo)儀或?qū)I(yè)設(shè)備的可用性。
5. 預(yù)算：凱氏定氮法和ELISA的成本差異顯著。

三、特殊場景的檢測技術(shù)

• 熒光法（如NanoOrange、SYPRO Orange）：通過熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)，靈敏度達(dá)ng級，適用于微量樣品。
• 質(zhì)譜法：精確測定蛋白質(zhì)分子量及含量，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
• 紅外光譜法：快速無損檢測食品中的蛋白質(zhì)含量。

四、注意事項

1. 標(biāo)準(zhǔn)品匹配：盡量選擇與待測樣品同源的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如檢測牛血清白蛋白使用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
2. 干擾物質(zhì)處理：
   • 去除脂類（有機(jī)溶劑萃取）、核酸（核酸酶消化）或還原劑（透析）。
3. 重復(fù)實驗：尤其是異質(zhì)性樣品需多次測定取平均值。
4. 儀器校準(zhǔn)：定期校驗分光光度計波長及吸光度準(zhǔn)確性。

五、應(yīng)用領(lǐng)域

• 食品工業(yè)：凱氏定氮法認(rèn)證蛋白質(zhì)含量標(biāo)簽。
• 生物制藥：BCA法監(jiān)控純化工藝中的蛋白回收率。
• 臨床診斷：ELISA檢測血清中的特定疾病標(biāo)志物。
• 科研實驗：Bradford法測定細(xì)胞裂解液總蛋白以標(biāo)準(zhǔn)化上樣量。

六、