RNA提取與檢測(cè)技術(shù)全流程解析

一、技術(shù)原理與核心挑戰(zhàn)

核糖核酸（RNA）是基因表達(dá)的關(guān)鍵載體，其提取與檢測(cè)是分子生物學(xué)研究的基石。該過程面臨核心挑戰(zhàn)：無(wú)處不在的RNA酶（RNase）。這類酶活性極強(qiáng)，能迅速降解RNA分子。此外，RNA自身的不穩(wěn)定性也對(duì)操作的時(shí)效性和環(huán)境控制提出高要求。

二、標(biāo)準(zhǔn)操作流程詳解

• 樣本前處理：

  • 組織樣本： 快速取材后投入液氮速凍或?qū)Ｓ帽４嬉海苊釸NA降解。研磨需在液氮或低溫環(huán)境下進(jìn)行，確保充分勻漿。
  • 細(xì)胞樣本： 胰酶消化后立即裂解或離心收集細(xì)胞沉淀，快速進(jìn)入裂解步驟。
  • 血液樣本： 通常使用含抗凝劑的采血管，需盡快分離目標(biāo)細(xì)胞（如白細(xì)胞）或血漿/血清，并加入裂解液。

• 細(xì)胞裂解：

  • 使用強(qiáng)變性裂解液（常含異硫氰酸胍、苯酚、SDS等成分），高效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放核酸并使RNase失活。
  • 關(guān)鍵點(diǎn)： 裂解需快速、徹底，確保樣本與裂解液充分混勻。

• 核酸分離：

  • 有機(jī)溶劑萃取法（如Trizol法）： 加入氯仿等有機(jī)溶劑離心分層，RNA選擇性進(jìn)入上層水相，DNA和蛋白質(zhì)位于中間層及下層有機(jī)相。
  • 硅膠膜吸附法（離心柱法）： 裂解液經(jīng)特定條件（如高鹽、乙醇存在）處理后，RNA特異地結(jié)合到硅膠膜上，后續(xù)通過洗滌去除雜質(zhì)。此法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛。
  • 磁珠法： 表面修飾的磁珠在特定緩沖條件下特異吸附RNA，利用磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)分離和洗滌，適合自動(dòng)化高通量提取。

• RNA純化：

  • 徹底去除殘留的蛋白質(zhì)、基因組DNA（gDNA）、鹽離子、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。
  • DNase處理： 通常在純化過程中或純化后加入無(wú)RNase的DNase酶，消化殘留的gDNA，這對(duì)后續(xù)RT-qPCR等應(yīng)用至關(guān)重要。
  • 洗滌： 使用不同濃度的乙醇緩沖液清洗吸附材料（硅膠膜或磁珠），去除雜質(zhì)。
  • 干燥（離心柱法）： 離心去除殘留乙醇。
  • 洗脫： 使用無(wú)RNase水或低鹽緩沖液將純化的RNA從吸附材料上洗脫下來。

• 濃度與純度測(cè)定：

  • 紫外分光光度法：
    • 原理： 利用核酸在260nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰。
    • 操作： 取少量RNA溶液，使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD260值。
    • 計(jì)算濃度： RNA濃度 (ng/µL) ≈ OD260值 × 40 × 稀釋倍數(shù)。
    • 評(píng)估純度：
      • OD260/OD280比值： 反映蛋白質(zhì)污染程度。純凈RNA比值約為1.8-2.1。低于1.8提示蛋白質(zhì)殘留；高于2.1可能提示殘留異硫氰酸胍或苯酚。
      • OD260/OD230比值： 反映小分子雜質(zhì)（如鹽離子、胍鹽、EDTA、酚、乙醇等）污染程度。純凈RNA比值應(yīng)大于2.0。低比值提示需進(jìn)一步純化。

• 完整性評(píng)估：

  • 瓊脂糖凝膠電泳：
    • 原理： 基于分子量大小分離核酸。
    • 操作： 取適量RNA與上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于含核酸染料的瓊脂糖凝膠（通常1-2%）上，進(jìn)行電泳。
    • 結(jié)果判讀：
      • 真核生物總RNA： 應(yīng)清晰可見28S rRNA和18S rRNA兩條主帶，28S條帶亮度約為18S的1.5-2倍。條帶應(yīng)銳利，無(wú)拖尾現(xiàn)象。5S rRNA及tRNA條帶通常較弱。
      • 完整性指標(biāo)： 28S/18S比值接近2:1是完整RNA的標(biāo)志。出現(xiàn)smear（涂抹）或主帶缺失/變?nèi)跆崾窘到狻?/li>
    • 優(yōu)點(diǎn)： 直觀，成本低。
    • 缺點(diǎn)： 靈敏度有限，需樣本量相對(duì)較多，EB染料有毒性（可選用安全染料）。
  • 微流控芯片電泳（如Bioanalyzer, TapeStation）：
    • 原理： 自動(dòng)化微流控芯片技術(shù)結(jié)合熒光檢測(cè)。
    • 操作： 將少量RNA樣本與染料、標(biāo)記物、上樣緩沖液混合，注入芯片孔道，儀器自動(dòng)完成電泳、檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。
    • 結(jié)果輸出：
      • 電泳圖： 顯示rRNA峰圖（真核樣本）。
      • RNA完整值： 根據(jù)峰圖計(jì)算出的數(shù)值化指標(biāo)（如RIN, RQI, DIN等），范圍通常1-10，數(shù)值越高代表完整性越好（如RIN > 7通常認(rèn)為質(zhì)量良好）。
      • 濃度估算。
    • 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高，樣本用量少（ng級(jí)），自動(dòng)化，提供客觀的RIN值，通量較高。
    • 缺點(diǎn)： 儀器和耗材成本高。

三、常見問題與解決方案

• 低得率：
  • 樣本起始量不足。
  • 裂解不充分（組織未磨碎，細(xì)胞未完全裂解）。
  • 結(jié)合/吸附效率低（離心柱或磁珠問題，裂解液/結(jié)合液比例不當(dāng)）。
  • 洗滌過程中RNA丟失（過度洗滌）。
  • 洗脫不充分（洗脫液體積過小、次數(shù)少或未充分接觸）。
• 純度差（OD260/280低）：
  • 蛋白質(zhì)污染（裂解不徹底，洗滌不充分）。
  • 樣本本身富含蛋白/多糖/脂質(zhì)（如植物、脂肪組織、血液）。
  • 分光光度計(jì)測(cè)量誤差（溶液pH值影響極大，低濃度樣本誤差大）。
• 純度差（OD260/230低）：
  • 鹽離子殘留（洗滌不充分，未按要求使用乙醇）。
  • 胍鹽、酚、乙醇等有機(jī)溶劑殘留（洗滌不充分，干燥不徹底）。
  • 碳水化合物或胍鹽污染。
• RNA降解：
  • 樣本離體后未及時(shí)處理或保存不當(dāng)。
  • 操作過程中RNase污染（環(huán)境、器皿、試劑、手）。
  • 裂解液效力不足或失效。
  • 操作溫度過高（未在冰上操作）。
• gDNA殘留：
  • DNase消化效率低（酶失活、反應(yīng)條件不當(dāng)、含抑制物）。
  • DNase消化后未完全去除或滅活。

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)防RNase污染：
   • 全程佩戴一次性手套并勤換。
   • 使用無(wú)RNase的專用耗材（離心管、槍頭等）。
   • 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、移液器表面定期用專用RNase清除劑或稀釋的次氯酸鈉溶液擦拭。
   • 配制溶液使用無(wú)RNase的水（如經(jīng)DEPC處理并高壓滅菌的超純水）。
   • 盡可能在低溫（冰上）操作。
2. 樣本新鮮度： 離體樣本應(yīng)盡快處理或投入穩(wěn)定化試劑/液氮中。
3. 試劑與耗材質(zhì)量： 確保使用合格且未過期的試劑耗材。
4. 操作規(guī)范： 嚴(yán)格遵循所選方法的操作規(guī)程。
5. 儀器校準(zhǔn)： 定期校準(zhǔn)分光光度計(jì)、離心機(jī)等儀器。
6. 結(jié)果判讀： 結(jié)合濃度、純度比值和完整性評(píng)估（電泳或RIN值）綜合判斷RNA質(zhì)量是否適合下游應(yīng)用。

成功的RNA提取與檢測(cè)是獲得可靠分子生物學(xué)數(shù)據(jù)的前提。理解原理、優(yōu)化流程、嚴(yán)格防控RNase污染、規(guī)范操作并準(zhǔn)確解讀檢測(cè)結(jié)果，是獲得高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵。研究者應(yīng)根據(jù)樣本類型、下游應(yīng)用需求和實(shí)驗(yàn)室條件，選擇最適合的提取與檢測(cè)方法。