非洲馬瘟血球凝集與血球凝集抑制試驗(yàn)檢測(cè)的重要性

非洲馬瘟（African Horse Sickness, AHS）是一種由非洲馬瘟病毒（AHSV）引起的烈性傳染病，主要感染馬、騾、驢等馬科動(dòng)物，通過(guò)蚊蟲(chóng)等吸血昆蟲(chóng)傳播。該病具有高致死率（可達(dá)90%以上）和快速傳播的特點(diǎn)，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為須通報(bào)的動(dòng)物疫病。在疫病防控中，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是早期診斷、疫情監(jiān)測(cè)和疫苗免疫效果評(píng)估的核心手段。其中，血球凝集試驗(yàn)（Hemagglutination Assay, HA）和血球凝集抑制試驗(yàn)（Hemagglutination Inhibition Assay, HI）因其操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，被廣泛用于非洲馬瘟病毒的抗原檢測(cè)及抗體水平分析。

檢測(cè)項(xiàng)目及原理

1. 血球凝集試驗(yàn)（HA）：用于檢測(cè)樣本中是否存在非洲馬瘟病毒抗原。病毒表面的血凝素蛋白可與特定動(dòng)物（如馬或小鼠）的紅細(xì)胞表面受體結(jié)合，導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，形成肉眼可見(jiàn)的網(wǎng)格狀沉淀。凝集效價(jià)越高，表明病毒濃度越高。
2. 血球凝集抑制試驗(yàn)（HI）：通過(guò)已知病毒抗原與待測(cè)血清中的抗體反應(yīng)，評(píng)估血清中的特異性抗體水平。若血清中含有抗體，則會(huì)與病毒結(jié)合并阻止其凝集紅細(xì)胞，從而抑制凝集現(xiàn)象，通過(guò)效價(jià)判斷抗體濃度。

檢測(cè)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)需配備以下核心設(shè)備與材料：
- 酶標(biāo)儀或微量反應(yīng)板（U型或V型）
- 微量移液器及配套吸頭（10-200μL）
- 離心機(jī)（用于紅細(xì)胞洗滌）
- 恒溫培養(yǎng)箱（37℃±1℃）
- 生物安全柜（防止病毒氣溶膠污染）
- 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2-7.4）
- 1%紅細(xì)胞懸液（常用馬或小鼠紅細(xì)胞）
- 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與陰性對(duì)照血清

檢測(cè)方法與步驟

血球凝集試驗(yàn)（HA）流程：
1. 樣本處理：待檢組織勻漿液或細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)離心取上清，滅活后備用。
2. 紅細(xì)胞制備：采集健康動(dòng)物抗凝血，經(jīng)PBS洗滌后配成1%懸液。
3. 病毒稀釋：將樣本做2倍系列稀釋（如1:2至1:4096）。
4. 加樣反應(yīng)：每孔加入等量紅細(xì)胞懸液，37℃孵育1小時(shí)。
5. 結(jié)果判定：觀察紅細(xì)胞沉淀模式，完全凝集的最高稀釋度為HA效價(jià)。

血球凝集抑制試驗(yàn)（HI）流程：
1. 血清處理：56℃水浴30分鐘滅活非特異性抑制因子。
2. 抗體稀釋：血清從1:10開(kāi)始進(jìn)行2倍系列稀釋。
3. 加入病毒：每孔加入4單位HA效價(jià)的病毒液，37℃作用1小時(shí)。
4. 添加紅細(xì)胞：加入1%紅細(xì)胞懸液，孵育后觀察凝集抑制情況。
5. 效價(jià)計(jì)算：完全抑制凝集的血清最高稀釋度即為HI效價(jià)（如1:160）。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制

非洲馬瘟HA/HI試驗(yàn)需遵循國(guó)際及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：
- WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)》：規(guī)定紅細(xì)胞種類(lèi)、反應(yīng)溫度及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)。
- GB/T 22330-2008（中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）：明確樣本處理、試劑配制及試驗(yàn)重復(fù)性要求。
- 質(zhì)量控制要點(diǎn)：每批次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（已知效價(jià)血清）、陰性對(duì)照（PBS）和紅細(xì)胞自凝對(duì)照，確保反應(yīng)體系特異性。HI效價(jià)≥1:40判定為陽(yáng)性，提示動(dòng)物具有免疫保護(hù)力或感染后恢復(fù)期。

結(jié)語(yǔ)

血球凝集與抑制試驗(yàn)作為非洲馬瘟診斷的經(jīng)典方法，兼具成本低、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于基層實(shí)驗(yàn)室和田間監(jiān)測(cè)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR等檢測(cè)手段逐漸普及，但HA/HI仍是抗體水平評(píng)估和疫苗免疫效果驗(yàn)證的“金標(biāo)準(zhǔn)”。未來(lái)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與自動(dòng)化儀器的結(jié)合，該技術(shù)將在AHS防控中持續(xù)發(fā)揮重要作用。