豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測的重要性

豬瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性、致死性傳染病，對養豬業造成巨大經濟損失。由于該病毒傳播速度快、致死率高，且與非洲豬瘟（ASF）癥狀相似，快速、準確的實驗室檢測技術成為防控疫情的核心手段。實時熒光逆轉錄聚合酶鏈式反應（Real-time RT-PCR）因其高靈敏度、特異性和快速檢測能力，被廣泛應用于CSFV的分子診斷。該方法可直接從樣本中檢測病毒RNA，在感染早期或潛伏期即可實現精準識別，為疫病監測、疫情處置及凈化工作提供科學依據。

檢測項目與目標

豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測的主要目標是通過特異性引物和探針，擴增并檢測CSFV基因組中的保守區域（如5'UTR、E2或NS5B基因片段）。檢測樣本包括：感染豬只的血液、脾臟、淋巴結、扁桃體等組織樣本，或環境拭子、飼料等潛在污染源。檢測結果可明確樣本中是否存在CSFV核酸，并可通過Ct值（循環閾值）半定量評估病毒載量，為臨床診斷和流行病學調查提供關鍵數據。

檢測儀器與設備

實時熒光RT-PCR檢測需依賴以下核心儀器： 1. 熒光定量PCR儀：如ABI 7500、Bio-Rad CFX96或Roche LightCycler，用于擴增核酸并實時監測熒光信號。 2. 核酸提取儀：自動化提取設備（如QIAGEN QIAcube）或手動試劑盒，用于從樣本中純化病毒RNA。 3. 超凈工作臺與離心機：確保樣本處理過程無污染。 4. 微量分光光度計或熒光計：用于檢測RNA純度與濃度。 此外，需配備-80℃超低溫冰箱用于試劑及樣本保存，以及生物安全柜操作高風險樣本。

檢測方法與步驟

檢測流程分為四個關鍵階段： 1. 樣本前處理：組織樣本經勻漿、離心后取上清液，血液樣本直接裂解處理。 2. RNA提取：使用TRIzol法或商業化RNA提取試劑盒，遵循“分區操作”原則避免交叉污染。 3. RT-PCR擴增： - 配置反應體系：包含逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、特異性引物及TaqMan探針。 - 設置擴增程序：通常為50℃逆轉錄15分鐘，95℃預變性10分鐘，隨后進行40-45個循環的變性（95℃ 15秒）、退火/延伸（60℃ 1分鐘）。 4. 結果判讀：根據熒光信號增長曲線和Ct值判定陰陽性（Ct≤38為陽性，38＜Ct＜40需復檢，無擴增曲線為陰性）。實驗需設置陽性對照、陰性對照和內部質控（如β-actin基因）。

檢測標準與質量控制

豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測需遵循以下國際及國內標準： - OIE標準：《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中規定的CSFV檢測指南。 - 國家標準：GB/T 36871-2018《豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法》。 - 行業規范：NY/T 1187-2020《動物疫病分子檢測實驗室技術規范》。 實驗室需定期進行能力驗證（PT），使用標準物質校準儀器，并通過設立重復樣本、空白對照確保檢測結果的重復性與準確性。檢測報告需明確標注檢測限（LOD）、擴增效率（90%-110%）及交叉驗證數據（如與ELISA、病毒分離結果的一致性）。

通過標準化操作流程與嚴格質控，實時熒光RT-PCR技術可實現對豬瘟病毒的高效監測，為疫病防控提供可靠的技術支撐。