水溶性蛋白檢測：核心檢測項目詳解

一、濃度測定

1. • 原理：堿性條件下蛋白質將Cu²?還原為Cu?，與BCA試劑形成紫色復合物，于562 nm測吸光度。
   • 優點：耐受低濃度去污劑（如1% SDS）。
   • 缺點：受還原劑（如DTT）干擾，需稀釋樣本。
2. • 原理：考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后由紅轉藍，于595 nm檢測。
   • 優點：快速（5分鐘）、靈敏度高（1-20 μg/mL）。
   • 缺點：易受去污劑（如Triton X-100）影響。
3. • 原理：利用色氨酸、酪氨酸在280 nm處的吸收峰。
   • 適用場景：純化后樣品，需排除核酸污染（A260/A280比值評估純度）。

二、純度分析

1. • 步驟：電泳分離后考馬斯亮藍或銀染，觀察單一條帶。
   • 分辨率：可區分分子量差異＞5 kDa的蛋白質。
2. • 類型：尺寸排阻色譜（SEC，分析聚集狀態）、離子交換色譜（IEX，檢測電荷異質性）。
   • 優勢：定量精確，自動化程度高。
3. • 特點：高分辨率、低樣品消耗，適用于微量樣品分析。

三、分子量測定

1. SDS-PAGE結合Marker
   • 常規方法，誤差約±10%。
2. 質譜分析（MALDI-TOF/ESI-MS）
   • 精確度：可達±0.01%，適用于翻譯后修飾分析。

四、結構分析

1. 圓二色光譜（CD）
   • 檢測二級結構（α-螺旋、β-折疊比例）。
2. 熒光光譜
   • 分析三級結構變化（如色氨酸微環境改變）。
3. 動態光散射（DLS）
   • 測定流體力學半徑，評估蛋白質聚集狀態。

五、功能活性檢測

1. 酶活測定
   • 方法：檢測底物消耗或產物生成速率（如NADH在340 nm吸光度變化）。
2. 免疫學活性（ELISA/Western Blot）
   • 驗證抗原抗體結合能力。
3. 受體結合實驗（SPR/BLI）
   • 實時監測蛋白與受體相互作用動力學。

六、穩定性評估

1. 溫度/pH耐受性
   • 通過濁度法（OD350）監測聚集沉淀。
2. 長期儲存穩定性
   • 定期檢測活性和溶解度，優化保存條件（如添加甘油或凍干）。

實驗設計要點

• 標準曲線：每次實驗需新鮮制備，涵蓋預期濃度范圍。
• 對照設置：陰性對照（緩沖液）、陽性對照（已知濃度蛋白）。
• 重復性：至少3次技術重復，確保數據可靠性。

總結