一、核心檢測項目及技術方法

1. 純度與雜質分析

• HPLC純度檢測 采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），使用C18色譜柱，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），檢測波長494 nm（熒光素特征吸收峰）。通過峰面積歸一化法計算主成分純度（通常要求≥98%），并定量分析雜質（如二聚體、異構體）。
• 紫外-可見吸收光譜（UV-Vis） 測定熒光素在pH 8.0緩沖液中的吸收光譜，驗證最大吸收波長（490-494 nm）是否符合標準，判斷是否存在氧化或降解產物。

2. 熒光性能評估

• 激發與發射光譜 使用熒光分光光度計，掃描熒光素的激發光譜（Ex=450-500 nm）和發射光譜（Em=510-550 nm），驗證其峰值波長是否與理論值一致（Ex 494 nm/Em 521 nm）。
• 熒光量子產率（Φ） 以硫酸奎寧為參比（Φ=0.55），通過積分球法或相對法測定熒光素的量子產率（理論值Φ≈0.92），確保其發光效率滿足標記實驗需求。

3. 穩定性測試

• pH依賴性測試 將熒光素溶解于不同pH緩沖液（pH 5.0-9.0），測定熒光強度變化，確定其最佳使用pH范圍（pH 7.4-8.5時熒光強度最高）。
• 光穩定性與熱穩定性 模擬長期儲存條件：避光/光照（紫外燈照射）、高溫（40℃）環境，定期檢測熒光強度衰減率，評估有效期。

4. 生物相容性檢測（用于活體/細胞實驗）

• 細胞毒性（MTT法） 將不同濃度熒光素與細胞共培養24小時，檢測細胞存活率，驗證其濃度安全閾值（通常≤10 μM）。
• 體內代謝速率 在小鼠模型中注射熒光素，通過活體成像系統動態監測熒光消退曲線（半衰期約30分鐘），評估其在生物體內的清除效率。

5. 定量分析標準曲線與檢測限

• 標準曲線繪制 配制系列濃度熒光素溶液（0.1 nM-10 μM），建立熒光強度（FI）與濃度的線性關系（R²>0.99），確定線性范圍。
• 檢出限（LOD）與定量限（LOQ） 按信噪比（S/N≥3）計算LOD（通常為0.1-1 nM），LOQ（S/N≥10）。

二、應用場景驗證檢測

1. 標記效率驗證

• 抗體/蛋白標記率 通過超濾離心法分離游離熒光素，測定偶聯物中熒光素與蛋白的摩爾比（F/P Ratio），優化標記條件（目標F/P=3-6）。
• 細胞膜穿透性測試 使用流式細胞術或共聚焦顯微鏡，定量分析熒光素標記探針的細胞內吞效率。

2. 環境監測應用

• 水樣痕量檢測 基于熒光素鈉的高水溶性，開發固相萃取結合熒光檢測法，檢測水體中熒光素殘留（檢測限可達ppb級）。
• 示蹤劑性能評估 在地下水流動模擬中，測定熒光素的遷移速率與回收率，驗證其作為水文示蹤劑的適用性。

三、質量控制關鍵點

1. 標準物質選擇 優先使用NIST可溯源熒光素鈉（CAS 518-47-8）作為對照品。
2. 樣品前處理 避免金屬離子污染（如Fe³?引起熒光猝滅），必要時添加EDTA掩蔽。
3. 儀器校準 定期校正熒光分光光度計的波長與光強，使用標準熒光微球校準成像設備。

四、總結