流行性潰瘍綜合征病原核酸檢測概述

流行性潰瘍綜合征（EUS），是一種由潰瘍分枝桿菌（*Mycobacterium ulcerans*）引起的嚴重皮膚及皮下組織慢性感染性疾病，主要流行于熱帶和亞熱帶地區的淡水環境附近。該病特征為大面積皮膚潰瘍，可導致永久性殘疾，早期診斷和干預至關重要。傳統的診斷方法（如涂片鏡檢、培養）存在耗時長、靈敏度低或操作復雜的局限性。病原核酸檢測技術，特別是針對*Mycobacterium ulcerans*特異性DNA序列（如插入序列IS2404、IS2606和酮還原酶基因KR）的檢測，因其高靈敏度、高特異性和快速出結果的優勢，已成為確診EUS的“金標準”和核心手段。它能夠在疾病早期，甚至在培養陰性或涂片陰性時檢出病原體，對于指導臨床治療、監測疫情和評估療效具有不可替代的作用。

檢測項目

流行性潰瘍綜合征病原核酸檢測的核心項目是檢測臨床樣本（主要為潰瘍邊緣的深部組織活檢樣本、抽吸物或拭子）中是否含有潰瘍分枝桿菌（*Mycobacterium ulcerans*）的特異性DNA片段。主要靶標基因包括：

1. 插入序列IS2404： 這是潰瘍分枝桿菌最特異的標志物，在單個菌體中存在高拷貝數（約200個拷貝），檢測靈敏度極高，是首選的靶標。

2. 插入序列IS2606： 同樣是潰瘍分枝桿菌高度特異的標志物，常與IS2404聯合檢測，通過多重PCR可進一步提高檢測的可靠性。

3. 酮還原酶基因(KR / mup038)： 該基因參與毒素（分枝桿菌內酯）的生物合成，也是特異性靶標之一。

檢測結果通常報告為靶標基因（如IS2404）的核酸“檢測到”或“未檢測到”。定量PCR還可提供病原體載量的信息。

檢測儀器

進行流行性潰瘍綜合征病原核酸檢測需要一系列精密的實驗室儀器：

1. 核酸提取設備： * 離心機： 用于樣本預處理和分離。 * 渦旋混合器/振蕩器： 充分混勻樣本和裂解液。 * 恒溫水浴鍋/金屬浴/干式恒溫器： 用于樣本裂解和孵育。 * 核酸提取儀（可選）： 自動化完成核酸提取純化步驟，提高效率和一致性（如基于磁珠法或柱提法的自動化平臺）。

2. 核酸擴增與檢測設備： * 聚合酶鏈式反應(PCR)儀/實時熒光定量PCR儀： 這是核心設備。用于對靶標DNA進行特異性擴增。實時熒光定量PCR儀能同時進行擴增和實時監測熒光信號，實現快速、定量檢測，是目前主流選擇。 * 電泳系統（若使用常規PCR）： 凝膠成像系統用于對PCR擴增產物進行電泳分離和結果判讀（已逐漸被實時熒光定量PCR取代）。

3. 輔助設備： * 超凈工作臺/生物安全柜： 提供無菌環境進行樣本處理和試劑配制，防止污染和保障操作者安全。 * 微量移液器及配套吸頭： 精確移取液體。 * 冰箱/超低溫冰箱： 儲存試劑、引物探針和核酸樣本。 * 超純水系統： 提供無核酸酶、無污染的水。 * 數據分析電腦及軟件： 用于運行儀器控制軟件和分析檢測數據（尤其是實時熒光定量PCR的結果分析）。

檢測方法

流行性潰瘍綜合征病原核酸檢測主要采用基于聚合酶鏈式反應（PCR）的技術：

1. 常規（終點）PCR： * 步驟： 核酸提取 -> PCR擴增（變性、退火、延伸循環） -> PCR產物凝膠電泳 -> 紫外燈下觀察特異性條帶。 * 優缺點： 操作相對簡單，成本較低；但無法定量，易受污染導致假陽性，靈敏度通常低于實時熒光定量PCR，且需要開蓋進行電泳，增加污染風險。

2. 實時熒光定量PCR (qPCR)： * 原理： 在PCR反應體系中加入熒光基團（如SYBR Green染料或特異性熒光探針如TaqMan探針），實時監測每個擴增循環中熒光信號的變化。熒光信號強度與擴增產物的量成正比，從而實現定量檢測（Ct值 - 達到設定熒光閾值所需的循環數）。 * 步驟： 核酸提取 -> 配制qPCR反應體系 -> 在qPCR儀上進行擴增并實時檢測熒光 -> 儀器軟件自動分析結果（根據擴增曲線和Ct值判讀）。 * 優缺點： * 優點： 高靈敏度、高特異性（尤其使用探針法）、閉管操作減少污染風險、快速（通常1.5-2小時出結果）、可實現定量、結果判讀客觀（軟件分析）。 * 缺點： 儀器和試劑成本相對較高。 * 常用類型： * 探針法（如TaqMan）： 特異性最好，常用于多重檢測（同時檢測IS2404和IS2606）。 * 染料法（如SYBR Green）： 成本較低，但需通過熔解曲線分析確認產物特異性。

核心步驟注意事項： * 樣本采集與處理： 正確采集深部組織樣本至關重要。避免使用消毒劑（如碘酒），因其可能降解DNA。樣本需妥善保存和運輸（通常冷藏或冷凍）。 * 核酸提取： 選擇高效的提取試劑盒，確保充分裂解分枝桿菌堅韌的細胞壁并去除PCR抑制劑（如組織降解產物、血色素）。 * 防污染措施： 嚴格分區操作（試劑準備區、樣本處理區、擴增及產物分析區）、使用帶濾芯吸頭、定期清潔工作臺、使用陰性對照和陽性對照監控實驗過程。

檢測標準

為確保流行性潰瘍綜合征病原核酸檢測結果的準確性、可靠性和可比性，需遵循嚴格的標準和規范：

1. 國際標準與指南： * 世界衛生組織（WHO）發布的關于潰瘍分枝桿菌病（布魯里潰瘍）的實驗室診斷指南，推薦PCR（特別是針對IS2404的實時熒光定量PCR）作為確診方法。 * 相關國際專業組織（如美國臨床和實驗室標準協會CLSI）發布的分子診斷通用指南和質量控制要求。

2. 國家/行業標準： * 各國衛生部門或標準化組織制定的傳染病病原體核酸檢測技術規范。例如，中國可能有相關的衛生行業標準（WS）或國家標準（GB）對分子生物學檢測的實驗室管理、方法性能驗證、質量控制等做出規定。 * 針對特定病原體的檢測標準操作程序（SOP）。

3. 方法學性能驗證標準： 實驗室在引入或建立檢測方法時，必須進行嚴格的性能驗證，包括： * 靈敏度： 確定最低檢測限（LoD），即能穩定檢出靶標的最低病原體數量或濃度。 * 特異性： 評估方法對目標病原體的識別能力，以及與近緣菌種（如其他分枝桿菌）或人體正常菌群/樣本基質的交叉反應情況。 * 精密度： 評估方法的重復性和重現性。 * 準確性： 通過與參考方法（如培養）或其他公認可靠方法的比較進行驗證。

4. 實驗室質量控制標準： 每次檢測運行必須包含： * 陰性對照： 不含靶標核酸的樣本（如無菌水或已知陰性樣本），用于監測污染。結果應為陰性。 * 陽性對照： 含有已知量靶標核酸的樣本，用于確認檢測體系有效運行。結果應為陽性。 * 內