白尾病病毒核酸檢測(cè)概述

白尾病病毒（White Tail Disease Virus, WTDV）是嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新型病原體，尤其對(duì)南美白對(duì)蝦等經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)造成毀滅性打擊。該病毒引發(fā)的典型癥狀包括蝦體尾部白化、運(yùn)動(dòng)障礙和急性死亡，傳播速度快，死亡率可達(dá)80%以上。核酸檢測(cè)作為病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)特異性識(shí)別病毒核酸序列，可在感染早期（潛伏期3-5天）實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)，較傳統(tǒng)病理學(xué)方法靈敏度提升1000倍以上。當(dāng)前該檢測(cè)已成為進(jìn)出口檢疫、種苗篩選和疫區(qū)監(jiān)測(cè)的核心技術(shù)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的生物安全防控具有戰(zhàn)略意義。

檢測(cè)項(xiàng)目

白尾病病毒核酸檢測(cè)主要針對(duì)病毒的特異性基因片段開(kāi)展。核心檢測(cè)項(xiàng)目包括：1) 病毒衣殼蛋白基因（CP基因）保守區(qū)檢測(cè)，該區(qū)域具有高度種屬特異性；2) RNA依賴(lài)的RNA聚合酶基因（RdRp）突變監(jiān)測(cè)，用于追蹤病毒變異；3) 多重靶標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)項(xiàng)目，同步篩查WTDV及其常見(jiàn)共感染病原（如十足目虹彩病毒）；4) 病毒載量定量分析，通過(guò)絕對(duì)定量評(píng)估感染程度。檢測(cè)樣本涵蓋蝦類(lèi)肝胰腺、鰓絲、肌肉組織及養(yǎng)殖水體懸浮物等。

檢測(cè)儀器

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室采用多層級(jí)儀器系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全流程檢測(cè)：1) 前處理階段使用組織勻漿器（如FastPrep-24）和高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5430R）；2) RNA提取采用磁珠法全自動(dòng)核酸提取儀（MagMAX? Pathogen RNA/DNA Kit）；3) 擴(kuò)增檢測(cè)核心設(shè)備為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI QuantStudio 7 Pro），其具備多通道熒光檢測(cè)能力；4) 高通量篩查使用數(shù)字PCR系統(tǒng)（Bio-Rad QX200）；5) 配套設(shè)備包括Nanodrop核酸濃度測(cè)定儀、生物安全柜（Class II）及-80℃超低溫冰箱。現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)則依賴(lài)便攜式恒溫?cái)U(kuò)增儀（Genie II）。

檢測(cè)方法

國(guó)際主流檢測(cè)方法形成三級(jí)技術(shù)體系：

金標(biāo)準(zhǔn)方法：實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR），采用TaqMan探針?lè)āｊP(guān)鍵步驟包括：① 組織樣本經(jīng)TRIzol法提取總RNA；② 使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；③ 采用OIE推薦引物組（Forward: 5'-GCTGTGTTTGGATGGAATCG-3', Reverse: 5'-CAGCAGGTGTTGTTGTTGCT-3'）和探針（FAM-CCGCCGTAGCCGCT-BHQ1）進(jìn)行擴(kuò)增；④ 循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃15s→60℃45s共40循環(huán)。

快速篩查方法：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP），63℃恒溫反應(yīng)30分鐘，通過(guò)羥基萘酚藍(lán)（HNB）顯色判讀結(jié)果。

確證方法：二代測(cè)序（Illumina NovaSeq）全基因組分析，用于新毒株鑒定和溯源研究。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系包含：

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》第3.2.10章規(guī)定：Ct值≤35且擴(kuò)增曲線呈典型"S"型判為陽(yáng)性，需經(jīng)雙向測(cè)序驗(yàn)證。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)《GB/T 40852-2021對(duì)蝦白尾病診斷規(guī)程》要求：① RNA純度OD260/280≥1.8；② 內(nèi)參基因（β-actin）Ct值≤28；③ 檢測(cè)限需達(dá)到10拷貝/μL。

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：執(zhí)行ISO/IEC 17025體系，每批次包含：陰性對(duì)照（DEPC水）、陽(yáng)性對(duì)照（ATCC VR-1417標(biāo)準(zhǔn)株）、提取空白對(duì)照。室間質(zhì)評(píng)需通過(guò)EURL for Crustacean Diseases年度能力驗(yàn)證。

最新行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（FAO/CAC GL 85-2023）新增數(shù)字PCR定量要求，病毒載量＞103拷貝/mg組織需啟動(dòng)疫區(qū)管控。