錦鯉皰疹病毒核酸檢測：精準診斷與防控的關鍵

錦鯉皰疹病毒病（Koi Herpesvirus Disease, KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus, KHV或CyHV-3）引起的一種高度傳染性、致死性魚類疫病，主要危害鯉魚和錦鯉。該病被世界動物衛生組織（WOAH, 原OIE）列為必須申報的水生動物疫病，在我國也屬于二類動物疫病。病毒感染后，常表現為鰓組織壞死、嚴重出血、表皮脫落、行為異常（如嗜睡、游動失衡）等癥狀，在適宜水溫（18-28°C）下潛伏期短、發病急、死亡率極高（可達80-100%），對養殖業造成毀滅性打擊。因此，建立快速、靈敏、準確的KHV核酸檢測方法，對于疾病的早期診斷、疫情監測、流通檢疫、引種安全及采取有效防控措施至關重要。核酸檢測能特異性識別病毒的遺傳物質（DNA），在病毒感染的早期或潛伏期即可檢出，具有靈敏度高、特異性強的顯著優勢。

檢測項目

錦鯉皰疹病毒核酸檢測的核心項目是檢測錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）的特異性DNA片段。主要針對病毒基因組中高度保守且特異性的區域，常用的靶基因包括：

• 胸苷激酶基因（TK基因）：是KHV基因組中非常保守且常被選為檢測靶點的區域。
• Sph-1蛋白基因：也是一個常用的、具有良好特異性的檢測靶標。
• 9/5基因：部分方法也以此為靶點。

檢測結果通常報告為“錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）核酸陰性”或“錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）核酸陽性”，有時還會提供循環閾值（Ct值）作為病毒載量的半定量參考。

檢測儀器

KHV核酸檢測主要依賴于分子生物學實驗室的精密儀器：

• 實時熒光定量PCR儀（Real-time PCR儀）：這是當前最主流、應用最廣泛的檢測儀器。它能夠在PCR反應過程中實時監測熒光信號的變化，無需開蓋進行凝膠電泳，大大減少了污染風險，并可通過Ct值進行相對定量。其靈敏度極高，可檢測到極微量的病毒DNA。
• 普通PCR儀：可進行常規的PCR擴增，但后續需要通過瓊脂糖凝膠電泳系統進行產物鑒定。這種方法靈敏度通常低于實時熒光定量PCR，且操作步驟多，有開蓋污染風險，在常規診斷和檢疫中應用已逐漸減少。
• 核酸提取儀：用于自動化地從魚體組織（如鰓、腎、脾、腦或體表粘液）樣本中提取純化病毒DNA/總核酸，提高提取效率、一致性和生物安全性。
• 高速冷凍離心機：用于樣本處理、核酸提取過程中的離心步驟。
• 超微量分光光度計/Nanodrop：用于快速測定提取核酸的濃度和純度（OD260/OD280比值）。
• 生物安全柜：提供無菌環境，保護操作人員和環境免受樣本潛在污染，是進行核酸提取和PCR體系配置的關鍵設備。
• 瓊脂糖凝膠電泳系統（普通PCR檢測用）：包括電泳槽、電源、凝膠成像系統或紫外透射儀，用于觀察PCR擴增產物條帶。

檢測方法

目前，實時熒光定量PCR（qPCR）方法是檢測KHV核酸的國際公認“金標準”，也是WOAH手冊和我國國家標準推薦的主要方法：

1. 樣品采集與處理：無菌采集患病或疑似患病魚只的鰓、腎、脾等組織，或無癥狀魚只的鰓、腎組織及體表粘液。樣品需低溫保存并及時送檢。實驗室中將組織勻漿，離心取上清或直接進行核酸提取。
2. 核酸提取：使用商品化的DNA提取試劑盒（如酚氯仿法、離心柱法或磁珠法）或自動化核酸提取儀，從處理好的組織上清液或粘液中提取病毒DNA。此步驟需設置陰性（無模板）對照和陽性（已知KHV DNA）對照。
3. 實時熒光定量PCR（qPCR）：
   • 反應體系配置：在反應管中加入PCR預混液（含Taq酶、dNTPs、緩沖液等）、針對KHV特定靶基因（如TK, Sph-1）的特異性引物（Primers）和熒光標記的探針（Probe）、以及提取的待測DNA模板。
   • 熒光標記：最常用的是水解探針（TaqMan探針）技術，探針兩端分別標記報告熒光基團（如FAM）和淬滅熒光基團。當探針完整時，淬滅基團抑制報告基團發光；PCR擴增時，Taq酶的水解活性將探針切斷，報告基團熒光得以釋放并被儀器檢測。
   • 擴增程序：在實時熒光定量PCR儀上進行熱循環，通常包括預變性、變性、退火/延伸（此步采集熒光信號）等步驟。儀器實時監測每個反應管中熒光強度的增長。
4. 結果判讀：
   • 儀器軟件根據熒光信號達到設定閾值（Threshold）時所經歷的循環數，即循環閾值（Ct值），進行判讀。
   • 陰性：陽性對照有典型的S型擴增曲線且Ct值在預期范圍內，陰性對照無擴增曲線（或Ct值≥40/無Ct值），待測樣品無擴增曲線（或Ct值≥40/無Ct值），報告為“錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）核酸陰性”。
   • 陽性：陽性對照和陰性對照結果正常，待測樣品出現典型的S型擴增曲線且Ct值小于設定的臨界值（通常Ct < 40），報告為“錦鯉皰疹病毒（CyHV-3）核酸陽性”。
   • 對于普通PCR方法，需進行瓊脂糖凝膠電泳，出現預期大小的特異性條帶判為陽性。

除標準qPCR外，環介導等溫擴增（LAMP）等恒溫擴增技術也可用于KHV的現場或快速篩查。

檢測標準

KHV核酸檢測必須遵循國際或國家/地區制定的標準操作規程，以確保結果的可靠性、可比性和權威性：

• 世界動物衛生組織（WOAH）手冊標準：WOAH《水生動物疾病診斷手冊》詳細規定了KHV的檢測方法，明確將基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR（針對TK基因或Sph基因）列為首選診斷方法，并給出了具體的引物、探針序列和反應條件要求。
• 中國國家標準（GB）：
  • GB/T 34749-2017 《錦鯉皰疹病毒病診斷規程》：這是我國現行的國家標準。該標準規定了KHV的臨床癥狀、病理變化、病毒分離、PCR檢測（包括普通PCR和實時熒光定量PCR）及血清學檢測（ELISA）等方法。其中實時熒光定量PCR（qPCR）法作為確診的首選方法，標準中提供了具體的引物、探針序列、反應體系和反應程序。
  • GB/T 36192 《活魚運輸技術規范》等檢疫標準中，也明確規定需對特定魚種進行KHV的檢測。
• 出入境檢驗檢疫行業標準（SN）：中國海關等出入境檢驗檢疫部門也有針對進口魚類KHV檢疫的行業標準，方法通常基于WOAH手冊和國標。
• 實驗室質量管理體系：進行檢測的實驗室通常需通過ISO/IEC 17025等認可，建立完善的質量管理體系文件（質量手冊、程序文件、作業指導書、記錄表格），對人員、設備、環境、樣品管理、方法確認/驗證、質量控制（每次實驗必須包含陰性對照、陽性對照、可能時加入內參基因對照）、結果報告等各環節進行嚴格規范。

綜上所述，錦鯉皰疹病毒核酸檢測是防控該重大疫病的核心技術手段