病毒性出血性敗血癥病毒核酸檢測

病毒性出血性敗血癥（Viral Hemorrhagic Septicemia, VHS）是一種由彈狀病毒科病毒（VHSV）引起的、對野生和養殖魚類（尤其是鮭鱒魚類）危害極大的高度傳染性疾病。該病以全身性出血、高死亡率為主要特征，已被世界動物衛生組織（WOAH, 原OIE）列為必須通報的水生動物疫病。早期、快速、準確地檢測VHSV對于防控疫情爆發、減少經濟損失、保障水產養殖業和水生生態安全至關重要。核酸檢測技術，特別是基于聚合酶鏈式反應（PCR）及其衍生技術的方法，因其極高的靈敏度、特異性和快速性，已成為診斷VHSV感染的金標準。

檢測項目

病毒性出血性敗血癥病毒核酸檢測的核心目標是特異性識別樣本中是否存在VHSV的核酸（RNA）。檢測項目具體包括：

1. VHSV定性檢測： 確證待檢樣本（如魚體組織勻漿液、血液、精卵液、水樣或環境擦拭子等）中是否存在VHSV核酸，用于診斷感染狀態、疫病監測和無疫認證。

2. VHSV基因型/亞型鑒定： 通過對特定基因片段（如糖蛋白G基因、核蛋白N基因或非編碼區）進行測序和分析，確定流行毒株的基因型（I, II, III, IV等）或亞型（如IVa, IVb），用于分子流行病學溯源和風險分析。

3. (可選)病毒載量定量（如適用）： 使用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術測定樣本中VHSV核酸的拷貝數或相對含量，可用于評估感染程度、疾病進程或治療效果。

檢測儀器

進行VHSV核酸檢測需要一系列精密的實驗室儀器設備：

1. 樣品制備設備： * 組織勻漿器/研磨儀：用于粉碎魚體組織。 * 離心機（高速、超高速）：用于分離樣品中的病毒顆粒、細胞碎片和雜質。 * 生物安全柜（II級及以上）：提供無菌環境和操作人員保護，防止氣溶膠污染和生物危害。 * 微量移液器（多量程）：精確轉移微量液體。

2. 核酸提取設備： * 核酸提取儀（自動化）：常用磁珠法或柱膜法自動化提取病毒RNA，提高效率和一致性。 * （或）渦旋混合器、水浴鍋/金屬浴：用于手工法核酸提取時的混勻和孵育。 * NanoDrop分光光度計/Qubit熒光計：用于測定提取RNA的濃度和純度（A260/A280比值）。

3. 核酸擴增與檢測設備： * 逆轉錄酶聚合酶鏈式反應儀（RT-PCR儀）：用于傳統的終點法RT-PCR，通常需要后續進行凝膠電泳分析。 * 實時熒光定量PCR儀（qRT-PCR儀）： 目前最主流的設備。在PCR擴增過程中實時監測熒光信號，實現“閉管”檢測和定量（或半定量）分析，具有高靈敏度、高特異性、快速、避免開蓋污染等顯著優勢。

4. 結果分析設備： * 凝膠成像系統：用于可視化終點法RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。 * 計算機及專業分析軟件：與qRT-PCR儀配套，用于采集、分析熒光數據，生成擴增曲線、熔解曲線，計算Ct值（循環閾值）和定量結果。

檢測方法

VHSV核酸檢測主要基于分子生物學技術，核心流程包括：

1. 樣品采集與前處理： 嚴格按照規范采集病魚或疑似魚的組織（腎、脾、心臟、腦是首選）、體液或環境樣本。樣品需在低溫下保存運輸，并在實驗室進行勻漿、離心等處理以釋放病毒顆粒。

2. 病毒RNA提取： 使用商品化的病毒RNA提取試劑盒（通常基于磁珠法或硅膠膜柱法），從處理后的樣品上清液中純化出病毒基因組RNA。此步驟需嚴防RNA酶降解。

3. 逆轉錄（RT）： 利用逆轉錄酶和特異性引物或隨機引物/oligo dT，將提取的單鏈RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA）。

4. 核酸擴增與檢測： * 常規RT-PCR： 將cDNA作為模板，使用針對VHSV高度保守區域（如G基因、N基因）設計的特異性引物進行PCR擴增。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，結合溴化乙錠或其他核酸染料染色，在紫外燈下觀察是否有預期大小的特異性條帶。該方法成本較低，但步驟繁瑣，易污染，靈敏度相對qRT-PCR稍低，且不能定量。 * 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）： * **探針法（如TaqMan）：** 最常用。在PCR反應體系中加入針對目標序列的特異性熒光標記探針（如FAM標記）。探針在完整時，報告基團（Reporter）的熒光被淬滅基團（Quencher）淬滅。擴增過程中，Taq酶具有5'→3'外切酶活性，會水解與模板結合的探針，使報告基團游離并釋放熒光信號。儀器實時監測熒光強度，達到設定閾值（Ct值）的循環數反映起始模板量。 * **染料法（如SYBR Green I）：** 使用能嵌入雙鏈DNA小溝的熒光染料。PCR擴增過程中，雙鏈產物形成后染料結合并發出熒光。具有成本優勢，但需通過熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）確認產物的特異性和單一性，否則非特異擴增或引物二聚體也會產生熒光信號造成假陽性。

5. 結果判讀： * RT-PCR：凝膠電泳出現預期大小的條帶判為陽性。 * qRT-PCR (探針法)：檢測通道出現典型的S型擴增曲線，且Ct值小于預設的陽性判定閾值（通常為35-40個循環，依具體驗證方案而定），判為陽性。陰性對照無擴增，陽性對照正常擴增。 * qRT-PCR (染料法)：除滿足擴增曲線要求外，熔解曲線必須出現單一的、與預期產物Tm（熔解溫度）值相符的峰。

6. 基因分型/測序（如需）： 對陽性PCR產物進行純化后直接測序，將序列與數據庫中的參考序列進行比對和進化樹分析，確定基因型/亞型。

檢測標準

VHSV核酸檢測的操作規程和質量控制需遵循國際和國家/地區的權威標準，確保結果的準確性、可靠性和可比性：

1. 世界動物衛生組織（WOAH）標準： * WOAH《水生動物疾病診斷手冊》中詳細規定了VHS的診斷方法，包括基于細胞培養的病毒分離（金標準）和替代方法——主要是核酸檢測（RT-PCR和qRT-PCR）。手冊提供了推薦的引物探針序列、樣本類型、核酸提取方法、檢測流程、陽性/陰性判定標準和質量控制要求（如內參基因、陰陽性對照、防污染措施等）。WOAH認證實驗室需嚴格遵循。

2. 國際標準（ISO）： * ISO 17025: 檢測和校準實驗室能力的通用要求。要求實驗室建立完善的質量管理體系。 * ISO 16140 系列：微生物學檢測方法的驗證和國際認可協議。適用于分子檢測方法的驗證（特異性、靈敏度、重復性、再現性等）。

3. 國家標準（例如中國）： * 《GB/T 15805.5-XXXX 魚類檢疫方法 第5部分：病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）》或相關國標/行標。這些標準通常會引用或等效采用WOAH手冊的核心內容，并結合本國實際情況制定具體的采樣、檢測技術要求和判定標準。

4. 歐盟指令/法規： * 歐盟針對水生動物疫病防控有詳細的指令（如Council Directive 2006/88/EC及其修訂版），對包括VHS在內的法定疫病的監測、控制、檢測方法和實驗室要求進行規定。

5. 內部質量控制（IQC）與外部質量評估（EQA）： * 每次檢測必須包含無模板陰性對照（NTC）、陽性對照（含已知量VHSV RNA或質粒）以及內參對照（如宿主β-actin基因或18S rRNA，監測RNA提取效率和抑制情況）。 *