眼刺激替代試驗-熒光素漏出法檢測的背景與意義

眼刺激試驗是評估化學品、化妝品及藥品對眼部安全性的重要檢測手段。傳統的動物試驗（如Draize試驗）因倫理爭議和種屬差異局限性，逐漸被體外替代方法取代。熒光素漏出法（Fluorescein Leakage Assay）作為一種基于離體角膜或重建角膜模型的方法，通過檢測熒光素鈉透過角膜屏障的能力，定量評估化學物質對眼表組織的刺激性。該方法具有高靈敏度、可重復性強及符合3R原則（替代、減少、優化）等優勢，已被OECD、ISO等國際標準組織納入推薦方法，廣泛應用于原料篩選和產品安全性評價。

檢測項目

熒光素漏出法主要針對以下核心項目進行檢測：
1. 角膜上皮屏障完整性的損傷程度
2. 化學物質引起的局部刺激性反應強度
3. 不同濃度梯度下刺激效應的劑量-反應關系
4. 角膜修復能力的動態變化（如結合時間梯度檢測）

檢測儀器

實驗需使用專業設備確保結果準確性：
- 熒光分光光度計：檢測熒光素鈉的滲透量（激發波長485nm，發射波長535nm）
- 角膜培養裝置：維持離體角膜的生理活性（如Ussing chamber）
- 精密電子天平：配制受試物溶液
- 倒置熒光顯微鏡：觀察角膜形態學變化
- 恒溫震蕩培養箱：控制孵育條件（溫度37±1℃，濕度90%以上）

檢測方法

標準化操作流程包括以下步驟：
1. 樣本制備：選取牛/兔離體角膜或重建人角膜上皮（RhCE）模型
2. 熒光素鈉處理：將角膜暴露于0.5%-1%熒光素鈉溶液10分鐘
3. 受試物暴露：按ISO標準設定暴露時間（通常15分鐘至4小時）
4. 孵育收集：用HBSS緩沖液收集滲透液（37℃震蕩孵育）
5. 定量檢測：通過熒光強度計算漏出率（Leakage Rate）
6. 結果分析：結合組織活性檢測（如MTT法）進行綜合評估

檢測標準

主要遵循的國內外標準包括：
- OECD TG 492：體外重建角膜模型檢測眼刺激試驗指南
- ISO 10993-10：醫療器械生物學評價第10部分刺激與致敏試驗
- ECVAM DB-ALM Protocol 124：熒光素漏出法標準化操作程序
- GB/T 16886.10-2017：中國醫療器械生物學評價標準
實驗需滿足質量控制要求：陰性對照漏出率≤5%，陽性對照漏出率≥20%，批內變異系數＜15%。