標(biāo)記基因（NPTII、HLT、PMI）定性PCR檢測(cè)方法

一、檢測(cè)背景與目的

二、檢測(cè)項(xiàng)目與流程

• NPTII（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II）：抗卡那霉素篩選標(biāo)記。
• HPT（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）：抗潮霉素篩選標(biāo)記。
• PMI（磷酸甘露糖異構(gòu)酶）：甘露糖代謝正向選擇標(biāo)記。

• DNA提取：使用CTAB法或商業(yè)DNA提取試劑盒（如DNeasy Plant Mini Kit）提取樣品基因組DNA。
• DNA純度檢測(cè)：通過分光光度計(jì)（A260/A280比值1.8–2.0）判定純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

• 引物序列（示例，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整）：
  • NPTII
    • 正向引物：5′-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3′
    • 反向引物：5′-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3′
    • 產(chǎn)物大小：~200 bp
  • HPT
    • 正向引物：5′-ATC GGC TCC TAT GGC TGT AG-3′
    • 反向引物：5′-CGT CTG TCG AGA AGC CGA AG-3′
    • 產(chǎn)物大小：~350 bp
  • PMI
    • 正向引物：5′-GCA CGG CGA GGA CCT ACA TA-3′
    • 反向引物：5′-TGG CGA TGG TGA TGA TCT TG-3′
    • 產(chǎn)物大小：~500 bp
• 特異性驗(yàn)證：通過NCBI BLAST比對(duì)確認(rèn)引物特異性，避免與非靶標(biāo)基因交叉反應(yīng)。

• 反應(yīng)體系（25 μL）：
  • 2× PCR Master Mix（含Taq酶、dNTPs、緩沖液）：12.5 μL
  • 正向引物（10 μM）：1 μL
  • 反向引物（10 μM）：1 μL
  • 模板DNA（50–100 ng/μL）：2 μL
  • ddH2O：8.5 μL
• 熱循環(huán)程序：
  • 預(yù)變性：95°C，5 min
  • 擴(kuò)增循環(huán)（35 cycles）：
    • 變性：95°C，30 sec
    • 退火：根據(jù)引物Tm值調(diào)整（NPTII：60°C；HPT：58°C；PMI：62°C），30 sec
    • 延伸：72°C，1 min/kb
  • 最終延伸：72°C，5 min

• 陽性對(duì)照：已知含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒或DNA樣本。
• 陰性對(duì)照：非轉(zhuǎn)基因樣本或無模板水。
• 內(nèi)參基因（如植物actin或tubulin）：驗(yàn)證DNA質(zhì)量與擴(kuò)增有效性。

• 瓊脂糖凝膠電泳：
  • 配制1.5%瓊脂糖凝膠，加入DNA Marker（如100 bp Ladder）。
  • 點(diǎn)樣PCR產(chǎn)物，電泳（電壓：5 V/cm，時(shí)間：30 min）。
  • 凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，比對(duì)目標(biāo)條帶大小。
• 判定標(biāo)準(zhǔn)：
  • 陽性：目標(biāo)位置出現(xiàn)清晰條帶，且大小與預(yù)期一致。
  • 陰性：無條帶或條帶大小不符。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 防污染措施：
   • 分區(qū)操作（試劑配制區(qū)、模板添加區(qū)、擴(kuò)增區(qū)）。
   • 使用帶UDG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）的預(yù)混液防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染。
2. 引物優(yōu)化：若出現(xiàn)非特異性條帶，可通過調(diào)整退火溫度或引物濃度優(yōu)化。
3. 物種特異性：檢測(cè)前確認(rèn)目標(biāo)物種基因組中無內(nèi)源性同源基因（如某些植物含PMI類似基因）。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

1. 轉(zhuǎn)基因作物（如玉米、大豆）的品系鑒定。
2. 食品或飼料中轉(zhuǎn)基因成分的快速篩查。
3. 環(huán)境樣本中轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)測(cè)。

五、參考文獻(xiàn)

• 引物設(shè)計(jì)參考NCBI GenBank（如NPTII：登錄號(hào)V00618）。
• 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)通用要求》（國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495系列）。